C. KROMOZOM ANALİZLERİ

Kromozom analizleri, ancak mitoz bölünme geçirmekte olan hücrelerde yapılabilmektedir. Spontan mitotik aktivitesi olan kemik iliği ve trofoblastların sitotrofoblast hücreleri özel bir hücre kültürü uygulamasına gerek duyulmadan sitogenetik analizlerde kullanılabililrken, diğer hücreler biolojik özelliklerine uygun ortamlarda hücre kültürüne gereksinim gösterirler.

Postnatal incelemeler için en uygun doku periferik kan lenfositleridir. İnceleme için steril koşullarda alınmış sodyum heparinli 2-3 ml periferik kan örneği yeterlidir. Gerek görülürse steril deri örnekleri de çalışılmaktadır. Materyal dondurulmadan oda ısısında, 24 saat içinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Periferik kan lenfositleri bir antijen ile kolaylıkla uyarılır ve 2-3 gün içinde yeterli miktarda hücre sayısına ulaşılır. Acil sonuçlar 2 günde, normal sonuçlar ise 1 hafta içinde alınır.

Prenatal incelemeler için uygun dokular;

15-20 ml amniotik sıvı örneği,

10 mg korion villus materyali,

1-2 ml heparinize fetal kan örneğidir.

Steril koşullarda alınan doku örnekleri en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalıdır. Abortus materyalinin steril olması ve üzerine herhangi bir madde ilave edilmeden laboratuvara gönderilmesi gerekmektedir.

Amniotik sıvı hücre kültürleri; uzun süreli hücre kültürlerine gereksinim duyarlar. Kültür süresi 7-14 gün arasındadır.

Korion villus dokusu; direkt ve uzun süreli olmak üzere 2 farklı yöntemle incelenmektedir. Direkt yöntemde, dokudaki spontan mitotik aktivitesi olan sitotrofoblast hücreleri kullanılır. Biopsiyi takip eden 5-6 saat içinde metafazlar elde edilebilir.

Trofoblast dokusu uzun süreli hücre kültürleri ile de çalışılmaktadır. Kültür süresi 6-12 gün arasındadır. Direkt yöntemle hızlı, uzun süreli hücre kültürü ile yüksek kaliteli kromozomlar elde edildiğiden her iki yöntemin birlikte kullanılması gerekmektedir.

Fetal kan örneği de periferik kan örneği gibi çalışılır ve sonuç 3-4 gün içinde alınır.

Abortus materyalinde inceleme trofoblast dokusunda uzun süreli kültür yöntemi ile yapılmaktadır ve sonuç 9-14 gün arasında alınır.

Kromozomların değerlendirilmesinde kullanılan teknikler

Kromozom analizinde hedef olası tüm anomalilerin saptanması olduğundan, kromozomların yapısal anomalilerinin de tanınmasına olanak sağlayan bantlama teknikleri kullanılmaktadır. Bunlar içinde en sıklıkla kullanılanı "GTG" bantlama tekniğidir. Gerekli durumlarda sentromer bantlama (CBG), satellit boyama (NOR), QFA, ters bantlama (RFG) gibi teknikler de kullanılmaktadır.

Kromozom analizlerinde kullanılan "yüksek resolüsyonlu bantlama tekniği (HRBT)" tekniği daha uzun kromozomlarda daha detaylı yapısal inceleme yapılmasına olanak sağlar. Özellikle Prader -Willi, Angelman, Di-George, Cri-du-chat, Miller Dieker, Willms tümörü, Retinoblastom gibi sendromlara yol açan "mikrodelesyon" sendromlarının tanısında uygulanır. Post ve prenatal kromozom analizlerinin 500-550 bant düzeyinde yapılması bu anomalilerin de tanınabilmesine olanak yaratır. Bu mikrodelesyonların HRBT ile dahi tanınabilmesi her zaman mümkün olamadığından "floresan in situ hibridizasyon" (FISH) adı verilen özel bir tekniğin uygulanması gerekebilir. "Frajil X" sendromu ve kromozom kırık sendromları gibi bazı durumlarda da özel kültür tekniklerinin uygulanması gerektiğinden ön tanının bilinmesi gerekmektedir.

Floresan in Situ Hibridizasyon (FISH) İncelemeleri

FISH tekniği, belli bir kromozomun, belli bir bölgesinin spesifik olarak boyanmasına olanak sağlayan moleküler ve sitogenetik tekniklerin birlikte kullanıldığı bir yöntemdir. Bu yöntem özellikle mikrodelesyon / mikroduplikasyon sendromlarının tanısında, klasik yöntemlerle açıklanamayan kromozom anomalilerinin aydınlatılmasında çok etkin bir yöntemdir. Ancak bu teknik sendroma veya anomaliye özgün uygulanabildiğinden ön tanı (klinik veya sitogenetik) konulmuş olması gerekmektedir. FISH ile tanı konulabilen bazı mikrodelesyon sendromları arasında PWS/AS, Williams, Wilms, Smith-Magenis, Di George sendromu vb. sayılabilir.

İnterfaz FISH tekniği ile trizomi taramaları

Bu teknik, interfaz evresindeki nukleuslarda 21, 18, 13, X ve Y kromozomlarının trizomilerini/ monozomilerini taramada kullanılmaktadır. Kültür gerektirmediğinden dokuya direkt uygulanmaktadır ve 24 saat içinde sonuç alınmaktadır. Bu tekniğin esası hücre çekirdeği içindeki söz konusu kromozomlardan kaç tane bulunduğunun floresan sinyalleri ile değerlendirilmesidir. Çok sayıda hücre değerlendirilir ancak yine de mozaiklerin, yapısal anomalilerin ve diğer kromozomları ilgilendiren anomalilerin tanınması mümkün olmadığından bu test "tarama testi" olarak isimlendirilmekte ve klasik kromozom analizlerinin yerini asla tutamamaktadır.